差異支原體PCR檢測試劑盒反應五要素

差異支原體PCR檢測試劑盒反應五要素：

參加PCR反應的物質(zhì)主要有五種即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+

引物：引物是PCR特異性反應的關(guān)鍵，PCR 產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度。理論上，只要知道任何一段模板DNA序列， 就能按其設計互補的寡核苷酸鏈做引物，利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴增。設計引物應遵循以下原則：

①引物長(cháng)度： 15-30bp，常用為20bp左右。

②引物擴增跨度： 以200-500bp為宜，特定條件下可擴增長(cháng)至10kb的片段。

③引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴增效果不佳，G+C過(guò)多易出現非特異條帶。ATGC*隨機分布，避免5個(gè)以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。

④避免引物內部出現二級結構，避免兩條引物間互補，特別是3'端的互補，否則會(huì )形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異的擴增條帶。

⑤引物3'端的堿基，特別是最末及倒數第二個(gè)堿基，應嚴格要求配對，以避免因末端堿基不配對而導致PCR失敗。

⑥引物中有或能加上合適的酶切位點(diǎn)， 被擴增的靶序列*有適宜的酶切位點(diǎn)， 這對酶切分析或分子克隆很有好處。

⑦引物的特異性：引物應與核酸序列數據庫的其它序列無(wú)明顯同源性。

引物量：每條引物的濃度0.1～1umol或10～100pmol，以*引物量產(chǎn)生所需要的結果為好，引物濃度偏高會(huì )引起錯配和非特異性擴增，且可增加引物之間形成二聚體的機會(huì )。

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